摘要：定量肽的筛选是LC-MS用于生物药定量分析的核心基础之一。本文围绕为什么要筛选定量肽？如何筛选定量肽？怎样验证定量肽实用价值？综合以mAb为主的生物药相关报道，并结合Proteome应用实际经验，以供相关方法开发参考。

为什么要筛选定量肽

不同于ELISA检测的目标物质为完整蛋白及其复合物，LC-MS可从内标蛋白、多肽两大层次[1]来实现生物药物的直接定量（图1），其中多肽具备合成快速、质量可控和成本低廉的优势，因此从酶解肽段水平来定量分析蛋白质药物是当前研究热点。由于酶解后肽段本身的长短、极性、稳定性千差万别；同时检测体系中液相色谱的分离能力、质谱的离子化效率直接影响肽段的响应值；此外还有酶解处理对肽段的选择性、以及待分析样本的种属来源。综合考虑上述因素，筛选一条或多条高特异性、高稳定性、高响应值的肽段作为定量肽，是开发LC-MS定量方法的首要条件。

图1  蛋白质定量标准品来源与基本流程

如何筛选定量肽

要筛选出满足实际需求的定量肽，不仅要考虑肽段自身的属性，还需要注意种属专属性以及检测体系适用等。目前相关行业研究人员相继报道了关于定量肽的多种筛选条件和辅助工具[2-5]，主要归纳为如下几点基本特征：

• 肽段唯一性：所选定量肽能显著区别所检目标药物与复杂生物基质，序列与其他生物蛋白无重合，即不受基质干扰；此外，最好是位于特征功能区，如抗体药物的定量肽一般在CDR区选择，可与抗原表位相关联；

• 序列长度合理：为保证肽段在液相的分离和质谱的电离效率高，一般选择肽段长度在6~20个，最好是在8~15个；既可以在分离梯度尽早出峰，又处于质谱扫描范围正态分布的最高区域；

• 氨基酸稳定性：常规希望疏水性氨基酸的比例应低于50%，保证肽段的可溶性；同时不含连续或交替的K、R氨基酸或者序列，以及不选择K、R的C-末端为P，避免酶切不完全；最为重要的是，排除掉一些高反应性的氨基酸及序列子，避免质谱信号不稳定。常见的排除氨基酸及序列子见表1。

• 延长肽必要性：在定量肽的C-末端适当增加3~5个氨基酸，作为延长肽，与待检样本同步进行酶解处理，可以及时反映蛋白质药物的酶解速率和酶解程度，还可以降低酶解过程带来的误差。

  表1  常见排除氨基酸/序列子及对应化学反应

1. 怎样验证定量肽实用价值

筛选后合成的多肽是否具备作为定量肽的价值呢？最终必须经过LC-MS体系的验证。首先需要考察合成肽段的电离效率和纯度，评价质谱信号响应范围，并根据碎片离子分布情况，选择高丰度的母子离对。然后选择适宜的液相体系，评估合成肽段在色谱的分离效果，获取定量肽段的特征保留时间。后续的蛋白质药物定量方法开发，将以这些关键信息为基础。

目前，都正检验正开发基于定量肽的LC-MS检测生物基质中生物药的浓度分布，并结合自身优势的临床试验联盟资源和软件算法，科学规范评价定量肽对目标生物药物的PK、PD影响，更好的服务于临床试验，欢迎咨询合作。

1. 参考文献

[1] Jenkins R, Duggan JX, Aubry AF, et al. Recommendations for validation of LC-MS/MS bioanalytical methods for protein biotherapeutics [J]. The AAPS Journal, 2015, 17 (1) : 1-16.

[2] Zheng J, Mehl J, Zhu Y, et al. Application and challenges in using LC-MS assays for absolute quantitative analysis of therapeutic proteins in drug discovery [J]. Bioanalysis, 2014, 6 (6) : 859-879.

[3] Campbell JL , Le Blanc JC. Peptide and potein drug analysis by MS: challenges and opportunities for the discovery environment [J]. Bioanalysis, 2011, 3 (6) : 645-657.

[4] 刘喜东，丛宇婷，钱小红，等. 酶切型稳定同位素标记肽段为内标用于药物代谢酶的绝对定量分析 [J].分析化学, 2015, 43 (10): 1551-1557.